載體構建流程方法（載體構建服務）

在分子生物學中，載體是一種可以攜帶外源核酸序列進入靶細胞中的物質，有質粒DNA載體、人工染色體載體、病毒載體等多種形式。基因工程最常使用的載體是質粒DNA載體，通常包含復制起點、啟動子、篩選標記等多種載體元件。構建質粒DNA載體的目的即是要將外源DNA片段插入到質粒骨架上。該質粒可以在宿主菌中自我復制，并且在一些情形下進一步用于下游的細胞轉染或者病毒包裝等實驗，從而實現外源DNA在靶細胞中的表達。

傳統實驗室方法構建含有目的基因的重組質粒DNA載體一般采用酶切連接法，其操作流程概括如下：

1、用一定量的DNA限制性內切酶切割質粒，使質粒出現缺口，切口處的黏性末端暴露；

2、再用DNA限制性內切酶處理目的基因的DNA片段，使其產生對應的黏性末端；

3、將處理好目的基因片段以與切割好的質粒混合。目的基因片段的黏性末端和質粒切口的黏性末端互補配對；

4、再加入適量的DNA連接酶，催化目的基因片段和質粒DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連接起來，形成一個重組質粒DNA分子。

5. 重組質粒DNA轉化大腸桿菌并擴增，然后篩選轉化后的克隆并驗證目的基因的連接效果。

對比效率較低的酶切連接法，云舟生物可使用多種高通量策略進行載體克隆。在我們的高度優化的克隆平臺上，一般的表達載體我們使用Gateway克隆和Gibson組裝等方式構建，而shRNA和gRNA載體則使用基于直接連接的方式快速構建。此外，根據具體項目的需要，我們也可以使用從頭基因合成、Golden Gate等方式構建載體。